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葫芦茶营养器官结构观察及有效成分含量和活性研究-生物化学与分

归档日期:07-17       文本归类:虎杖      文章编辑:爱尚语录

  葫芦茶营养器官结构观察及有效成分含量和活性研究-生物化学与分子生物学专业毕业论文.pdf

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  汕头大学硕士毕业论文 摘 要 葫芦茶(Tadehagitriquetrum (L.) Ohashi) 是豆科(Leguninose) 葫芦茶属 (Tadehagi Ohashi)植物葫芦茶的全草,以全草和根入药,是南药代表之一。有很 高的药用价值。本文采用植物解剖学、植物化学及色谱分析等方法,较为系统研 究了葫芦茶营养器官的形态结构及发育、有效成分的组织分布及积累规律,建立 了葫芦茶的黄酮类、酚类的有效成分的高效液相色谱分析方法;采用滤纸片法研 究了葫芦茶总黄酮提取物(FFT)对8种细菌的抑菌活性;通过邻苯三酚自氧化 体系,Feton体系和DPPH体系研究了FFT的抗氧化活性;应用MTT 法研究了 FFT 对Hela 和Ec109癌细胞的抗癌作用。研究结果如下: 1、植物解剖学方法研究表明:葫芦茶叶中脉维管束的厚角组织发达,髓部 较大,上下表皮都分布有单细胞的表皮毛;根、茎表面有较厚的木栓层,根中木 纤维较发达,根部导管里有晶体分布。葫芦茶结构中包含植物适应干旱生境的特 征。 2、利用组织化学和高效液相色谱-二极管阵列检测器(HPLC-DAD), 研究了葫芦茶营养器官中黄酮类、酚类成分在营养器官中的分布和积累规律。结 果表明:①黄酮类物质在叶中主要分布在中脉韧皮部、薄壁细胞、栅栏组织细胞 中,海绵组织细胞和皮层有少量分布;在茎和根中主要分布在皮层、韧皮部薄壁 细胞中。酚类物质在叶中主要分布在中脉韧皮部、薄壁细胞、栅栏组织细胞中; 在茎和根中主要分布在皮层、韧皮部薄壁细胞中。皂苷类物质在叶中都主要分布 在皮层、韧皮部薄壁细胞和栅栏组织细胞中,海绵组织细胞有少量分布;在茎中 都主要分布在皮层、韧皮部薄壁细胞中,在根中主要分布在皮层、韧皮部薄壁细 胞中。这些成分在木质部和髓部中都几乎没有分布。②HPLC 法测定葫芦茶黄酮 类、酚类物质含量结果表明:叶的总黄酮含量明显高于其他部位,9月份含量最 高,达5089.75μg芦丁/g 干重,茎和荚果是12月份含量最大,分别为834.88μ g芦丁/g干重和3687.16μg芦丁/g 干重,根是3月份含量最大,达1206.2μg芦 丁/g 干重。叶的酚类含量高于其他部位,11月份和12月份含量最大,达59.56 μg没食子酸/g干重,茎的含量各月份差别不大,荚果12月份含量最大,达13.4 μg没食子酸/g干重,根10月份含量最大,达31.96μg没食子酸/g 干重。 I 汕头大学硕士毕业论文 3、研究结果表明:FFT对Vp 为中度抑菌,抑菌圈为1.4cm,最小抑菌浓度 0.155g/ml Vm Val 为 ;对 、施氏假单胞菌、大肠杆菌、 为低度抑菌;在测试浓度 范围内,总黄酮提取物对P14、肠杆菌、Vf 均没有抑菌作用。FFT 能有效地清除 超氧阴离子自由基、羟基自由基、DPPH·,在试验浓度范围内,随着FFT 浓度的 加大,清除能力呈上升趋势。清除率分别达到98.9%、92.6%、79.85%。对DPPH· 自由基和羟基自由基的半抑制浓度IC 分别为0.034mg/ml 和0.140mg/ml。FFT 50 Hela Ec FFT 对 、 109细胞生长均表现出一定的抑制作用,且抑制率随着 浓度的 增加而增大,存在剂量依赖关系,其半抑制浓度IC 分别为37.64mg /ml,57.08mg 50 /ml。 关键词:葫芦茶;解剖结构;总黄酮;HPLC;抑菌活性;抗氧化性;MTT II 汕头大学硕士毕业论文 ABSTRACT ABSTRACT AABBSSTTRRAACCTT Tadehagitriquetrum(L.) Ohashi, akind of whole plant of Leguminosae Tadehagi Ohashi family, its whole plant and root can be used to make traditional Chinese medicine. It was one of representatives of the south pharmaceutical, which had high medicinal value. The structure of vegetative organs and the growth, histochemical localization and the accumulation of flavonoids and phenolic from Tadehagitriquetrum were systematically studied with the methodology of botanical anatomy, phytochemistry and chromatography. Tostudy bacteriostatic activity against 8 species of bacteria of flavonoids from Tadehagitriquetrum(FFT) by the method of filter paper. To study the antioxidant activity of FFT by Pyrogallol Autoxidation system, Feton system and DPPH system. Tostudy the antitumor Hela and Ec109 cells activity of FFT by the method of MTT. Results of this study can be summarized as follows: 1、The results of plantAnatomy showed that: Leaf vein vascular collenehyma of Tadehagitriquetrumwas developed. Palisadetissuse of leaf vein was large;The upper and lower epidermis were distributed the single cell of epidermis; There were thick cork phellogen distributed on the surface of root and stem, wood fiber of root was developed, catheter crystals were distributed inthe roots.The features for plants adapt toarid habitat characteristicswere containedinthe structures ofTadehagitriquetrum. 2、Study on localization and dynamic changes of flavonoids and polyphenols in vegetative organs of Tadehagitriquetrum (L.) Ohashi with the methodology of histochemical and high performance liquid chromatography (HPLC-DAD). The results showed that: ①Flavonoids were mainly distributed in the phloem, the thin-walled cells and the palisade tissue of leaf vein phloem.There was alittle amount of it distributed in the spongy tissue and the cortex; Which were distributed in the periderm and the parenchyma cells of phloem of stem and root. Phenolic was mainly distribution in the phloem, the thin-walled cells and the palisade tissue of leaf vein phloem; Which were distributed in the cortex of stem and the phloem of root. III 汕头大学硕士毕业论文 Saponins were mainly distributed in the cortex, the parenchyma cells of phloem, the palisade tissue of leaf. There was a little amount of it distributed in the spongy tissue; Which were distributed in the cortex of stem and the parenchyma cells of phloem of root. ②The results of HPLC showed that the content of total flavonoids of leaf was significantly higher than other parts. In 1g dry products, content of leaf was up to 5089.75 μg rutin in September. In 1g dry products, content of stem and pod were up to 834.88μg rutin and 3687.16 μ1g dry products, content of root was up to 1206.2 μg rutin in March. Phenolic content of leaf was significantly higher than other parts. In 1g dry products, content of leaf was up to 59.56 μg Gallic acid in November and December. Content of stem was made little difference. In 1g dry products, content of pod was up to 13.4 μg Gallic acid in December. In 1g dry products, content of root was up to 31.96 μg Gallic acid in October. 3 、The results showed that: FFT for Vp was moderate bacteriostatic, the bacteriostatic ring of Vp (V. parahaemolyticu) was 1.4cm, the minimum inhibitory concentration was 0.155g/ml; FFT for Vm(V. mimicus), Psendommas stain JP1, Escherichiacoli,Val(V.alginolyticus.)were low bacteriostatic; P14 (Rhodococcussp ), . Enterobacter.spCN1, Vf (V. flurialis) can’t be suppressed in the tested concentration range. Superoxide anion radicals, hydroxyl radicals, DPPH• can be cleared effectively byFFT.The clearance were up to 98.9%, 92.6%, 79.85% respectively. Half inhibition concentration IC on DPPH• and hydroxyl radicals were 0.034mg/ml and 50 0.140mg/ml respectively. The inhibitory activities of FFT on Hela and Ec109 were showed, suppression rate increased as the concentration increases and in a dose-dependent manner. The IC of FFT were 37.64mg/ml and 57.08mg/ml for Hela 50 andEc109 respectively. Key words: Tadehagitriquetrum (L.) Ohashi; anatomical structure; total flavonoids; HPLC;antibacterial activity; antioxidant activity; MTT IV 汕头大学硕士毕业论文 目 录 摘 要I ABSTRACTIII 目 录V 第1章 前 言1 1.1 葫芦茶简介1 1.1.1 葫芦茶的种类和资源1 1.1.2 葫芦茶的形态特征 1 1.1.3 葫芦茶的鉴定2 1.1.4 栽培技术 3 1.2 葫芦茶的国内外研究进展3 1.2.1 葫芦茶的化学成分 4 1.2.2 葫芦茶的药理作用 4 1.2.3 葫芦茶的临床运用 6 1.3 药用植物的解剖结构和化学成分的研究进展7 1.4 药用植物黄酮类生物活性研究进展9 1.4.1 抑菌活性 9 1.4.2 抗氧化性11 1.4.3 抗肿瘤活性12 1.5 课题研究的内容、目的及意义13 第2章 葫芦茶营养器官结构解剖学研究14 2.1 材料14 2.2 方法-冰冻切片法14 2.3 结果和分析15 2.3.1 叶的形态结构15 2.3.2 茎的形态结构16 2.3.3 根的形态结构16 第3章 葫芦茶器官有效成分的组织化学定位和含量研究18 3.1 材料和方法18 3.1.1 材料18 3.1.2 方法18 3.2 结果和分析21 3.2.1 黄酮类、酚类及皂苷类在各营养器官中的定位21 3.2.2 葫芦茶各营养器官中总黄酮、总酚的含量及其各月份的变化22 3.3 讨论24 3.3.1 葫芦茶营养器官的结构特点24 3.3.2 葫芦茶总黄酮总多酚物质储藏积累部位及含量比较25 第4章 葫芦茶总黄酮提取物的抑菌活性研究27 4.1 材料和方法27 4.1.1 材料27 4.1.2 方法27 4.2 结果和分析29 V 汕头大学硕士毕业论文 4.3 讨论30 第5章 葫芦茶总黄酮提取物的抗氧化活性研究32 5.1 材料和方法32 5.1.1 材料32 5.1.2 方法32 5.2 结果和分析33 5.2.1DPPH•抗氧化性测定结果 33 5.2.2 邻苯三酚(O •¯)自氧化测定结果34 2 5.2.3Feton 体系抗氧化性测定结果35 5.3 讨论36 第6章 葫芦茶总黄酮提取物的体外抗肿瘤作用38 6.1 材料和方法38 6.1.1 材料38 6.1.2 方法38 6.2 结果和分析40 6.2.1 葫芦茶的总黄酮提取物对2 种肿瘤细胞增殖的抑制作用40 6.2.2 葫芦茶的总黄酮提取物作用后2 种肿瘤细胞形态结构的变化42 6.3 讨论43 总 结45 参考文献47 图版说明54 图 版 Ⅰ55 致 谢56 硕士期间已发表及待发表论文情况57 VI 汕头大学硕士毕业论文 第1章 前 言 1.1 葫芦茶简介 1.1.1 葫芦茶的种类和资源 葫芦茶(Tadehagitriquetrum (L.) Ohashi)是豆科(Leguninose)葫芦茶属 (Tadehagi Ohashi)植物葫芦茶的全草,葫芦茶属植物包括6种,分布于亚洲热 带、太平洋群岛和澳大利亚北部。我国有2种,即葫芦茶[T.trquetrum(linn.) Ohashi] 和蔓茎葫芦茶[T.pseudatriquetrum(DC.) YangetHuang]。主产于广东、广西、海南、 [1-2] 江西、福建等南岭地区 ,是主要的南药代表之一。葫芦茶又称为百罗舌,金 葫芦,龙舌茶,山葫芦,龙舌红等。收载于《中国药典》1977 年版一部中,为 民间常用中草药。仅葫芦茶收载为药用的,药用部位是全草和根。也被收载于瓦 [3] 药和傣药 。 1.1.2 葫芦茶的形态特征 葫芦茶属于亚灌木,葫芦茶的根系并不发达,主根上有很多细小的不 定根,主根微粗,不定根较细,根的表面是浅黄白色的,长圆柱形,直的 或弯曲的,有时具分枝和须根,长短差别较大,长5~20cm,直径约 0.2~2cm, 入土较深,质地柔韧,不易折断。葫芦茶的嫩茎呈三棱状,分布着柔软的 小绒毛,较柔软。老茎呈圆柱状,秃净,坚硬,材质。葫芦茶的叶为单叶 互生,叶片卵状披针形至狭披针形,长 6~15cm,宽1~4cm,先端急尖,基 部浅心形或圆形,整个叶片形状形似葫芦。2 枚托叶,披针形,有纵脉。叶 柄长 1~3 cm,先端有 2 枚小托叶:托叶大,阔披针形,有纵脉。总状花序 长15~30cm:雄蕊 1 组,有 1 枚仅于上部略分离。荚果扁平,长 2~5 cm, 宽5~7mm,密被伏柔毛,无网脉:荚节4~8 个,宽大于长,长方状。花期 [4] 7~ 8 月。果期 10~11 月 。葫芦茶的荚果比较短,大约 2cm,两荚缝上附有 细软绒毛,果皮上没有毛,药材以叶多、色青带红、干燥、无粗梗者为佳。 1 汕头大学硕士毕业论文 药材性状、显微特征、理化鉴别特征较明显。葫芦茶的组织结构变异大, 茎从近三棱形转变至近圆形,纤维束从环状到断续成环,叶的主脉纤维管 [5] 束从7个转变成3个维管束 。蔓茎葫芦茶与葫芦茶最大的区别是茎的形状, 蔓茎葫芦茶的茎是平卧的,葫芦茶的茎则是披散状非直立的。 1.1.3 葫芦茶的鉴定 葫芦茶主要生长在低山处,或者路边灌丛中,气候温暖的地方,趋向 于向阳坡处生长,不耐寒,怕涝。对土壤要求不严,砂质壤土和粘壤土均 [6] 可 。 药材性状:棕褐色或棕黄色,老茎近圆形,质地比较坚韧,难折断, 表皮有细微的褶纹,有托叶痕突起,切面是黄白色。嫩茎近三棱形,黄绿 色,附着有粗毛。叶片红褐色,叶柄有托叶,容易脱落,气味淡香、味道 [6] 有点苦 。 显微特征:叶的横切图显示上、下表皮细胞均为单列的类方形细胞, 排列整齐紧密。叶肉的栅栏组织是 1 列短柱形的细胞,排列紧密整齐,且 栅栏组织不通主脉,主脉维管束有纤维群包围。嫩叶主脉有 5 个维管束, 老叶主脉维管束 3 个,2 小1 大。叶柄的主脉维管有 4 个对称维管束。茎的 横切图显示老茎是类圆形的,嫩茎是三棱形的,老茎木栓细胞由 4~8 列类 长方形细胞组成,细胞外壁厚且木质化。皮层较薄,细胞类圆形,有的细 胞内含方晶。韧皮部外方有纤维束散布且断续成环。形成层由 2~4 列细胞 组成。木质部宽,导管单个散布或 2~3 个聚集分布,射线 列细胞径 向延伸。髓部较小,细胞较大且类圆形,有的细胞内含方晶。粉末:黄白 色或黄棕色,气微香,味微苦。显微较多,韧皮纤维壁厚,木纤维壁较薄, 两端较尖,直径10~25 cm,晶纤维成束散在。方晶众多,方形或不规则型, 直径约 8~60 mm。具缘纹孔导管较多见,导管分子大,直径 50~60mm。非 腺毛两种均多,一种较大,直径6~20 mm , 长约 35~310 mm,壁有疣状突 起,另一种较小,壁薄,直径 5~10mm,长约50~70 mm,腺毛具柄,头部 均 2 个细胞组成小腺毛。上表皮细胞垂周壁平直,下表皮细胞为波浪状, [14] 气孔为平轴式。木栓细胞多角形,茎的表皮细胞长方形 。 2 汕头大学硕士毕业论文 葫芦茶粗粉用乙醇浸泡再超声,过滤得的滤液在 200~800 nm 的波长下 273 nm 257 nm 227 nm [6] 的紫外光谱扫描显示在波长 , , 下均有吸收峰 。 1.1.4 栽培技术 葫芦茶对土壤的要求较低,砂质壤土和粘壤土都可以生长,栽培时, 向阳的砂质壤土或者粘壤土均可选择,施于适量的发酵过的牛羊猪粪、尿 素、磷酸二铵作为肥料,翻耕成平畦地形或高畦地形,再进行种子繁殖或 [7] 扦插繁殖 。 1.2 葫芦茶的国内外研究进展 目前对葫芦茶的研究主要集中在化学结构的鉴定、临床研究和毒理学研究, 研究处于起步阶段,1998年和2000年中日学者对葫芦茶的化学成分进行了鉴定 [10-12] [60-62] 。国内学者对葫芦茶根和叶中的化学成分进行了定量分析 和葫芦茶种子 [7-8] [7,63] 发芽和栽培技术 的研究,国内学者对葫芦茶的药理药效有一些研究 。 1.2.1 葫芦茶的化学成分 [10-11] 葫芦茶主要含有的三类物质:黄酮类、酚类和三萜类 。 物质 化学成分 [12] [8] 黄酮类 芦丁 、4',7‐二羟基异黄酮、4‐羟基苯甲酸 、山柰素‐3‐O [8] ‐β‐D‐葡萄吡喃糖苷 、山柰素‐3‐O‐β‐D‐葡萄吡喃糖(6 ‐1)‐α‐L‐鼠李吡喃糖苷、4',5,7‐三羟基黄酮、山柰素‐3‐ O‐β‐D‐半乳吡喃糖苷、(+)‐儿茶素、山柰素‐3‐O‐β‐D ‐半乳糖(6‐1)‐α‐L‐鼠李吡喃糖苷、槲皮素‐3‐O‐β‐D‐ 半乳吡喃糖(6‐1)‐α‐L‐鼠李吡喃糖苷、槲皮素‐3‐O‐β‐D ‐葡萄吡喃糖苷、槲皮素‐3‐O‐β‐D‐葡萄糖(6‐1)‐α‐L‐ [9-11] 鼠李吡喃糖苷 。 、 [9 13] 酚类 没食子酸、水杨酸、原儿茶酸 、3,5‐二羟基苯基‐β‐D‐葡 3 汕头大学硕士毕业论文 [8] 萄吡喃糖苷、4‐羟基苯甲酸、(+)‐儿茶素 、3,5‐二羟基苯基‐6 ‐O‐反式‐对羟基肉桂酰基‐β‐D‐葡萄吡喃糖苷,命名葫芦茶 苷(Tadehaginoiside)。 三萜类 熊果酸、冬青素A[9-10] 其他物质 胡萝卜苷、豆甾醇、对甲基‐反式‐肉桂酸、木栓酮、表木栓酮 [3,9,12,13] [8] [2] 、鞣质 (7.1%~8.6 %)、二氧化硅 (SiO )(0.5~2.32 %)、氧化 2 [2] [8] 钾 (K O)(1.3~3.0%)、乌索酸 2 1.2.2 葫芦茶的药理作用 葫芦茶的药理研究表明:葫芦茶对椎实螺、寄生虫等有杀灭作用,但是,使 用过量又会在短期内影响动物的食欲;临床上常用于治疗前列腺增生、寄生虫病、 [14] 中暑、感冒、烧伤等症 。民间葫芦茶常被用于食品的驱虫,有报道葫芦茶可驱 除蛔虫、钩虫等。目前的文献报道主要是关于葫芦茶对寄生虫和椎实螺的杀灭作 用,而关于葫芦茶针对人体疾病的药理作用的研究报道甚少。 [15] Cyclokievitone 李树荣 等学者进行了兔球虫的卵囊的杀灭试验,实验发现 、 葫芦茶素D 的杀灭效果最佳,而葫芦茶素A 稍差,其他葫芦茶提纯物的药效和 对照组的差不多。 [16-17] 研究还采用葫芦茶粉剂和浸膏剂比较对山羊体内寄生虫卵的影响 。结果 以0.3g/kg 体重的葫芦茶浸膏剂投服剂量表现出山羊体内的蠕虫虫卵减少的现 象,当投服剂量达0.5g/kg 后则虫卵的数目减少更明显却不会消失。但球虫卵囊 的转阴率明显提高了。 还有研究用复方葫芦茶水提取液和丙硫苯咪唑对鱼体内的中华许氏绦虫的 [18] 驱除作用进行比较 。虽然使用丙硫苯咪唑驱除绦虫比较安全,但结果显示其杀 虫效果并不理想;而0.5%、1.5%浓度的复方葫芦茶水提取液比丙硫苯咪唑的驱 虫效果显著,同时还能改善水质,但是2.0%浓度以上的复方葫芦茶水提取液则 对鱼体表现出毒性。 [16] 李树荣 等学者研究了葫芦茶对椎实螺的杀灭作用。研究将葫芦茶提纯物、 L-2-O-甲基-手性肌醇(2-O-Methyl-L-chiro-inositol)、葫芦茶素D(Triquetin D)、葫 4 汕头大学硕士毕业论文 芦茶素C(Triquetin C)、山萘酚( Kaempferol)、二氢山萘酚(Dihydrokaempferol)、 (P-hydroxycinnamic acid) 4 ~16 对羟基桂皮酸 等配制药液处理椎实螺结果显示 ‰ ‰浓度的葫芦茶浸膏有较强的杀灭椎实螺效果,4天内可将其绝大部分甚至全部 杀灭,而0.05‰~0.1‰浓度的葫芦茶属D、山奈酚及空白对照组则在24h内将其 绝大部分甚至全部杀灭,推测葫芦茶素D、山萘酚、Cyclokieviton 则可能是杀灭 椎实螺的有效成分。 [19-20] 研究还将芦茶粉剂和煎剂作为杀灭药剂 都能杀灭椎实螺,其中粉剂的浓 度达0.1%时则24h内可致椎实螺死亡,而浓度达0.5%时则24h内椎实螺全部死 亡。而煎剂效浓度在 0.0143%时则48h 后可致椎实螺死亡,而有效浓度达0.572% 时则52h后椎实螺全部死亡。 [21] 研究还用葫芦茶浸膏剂对小白鼠做了毒性观察试验 ,一定量的葫芦茶浸膏 剂混合进饲料和饮用水中都能促进小白鼠的消化、增进食欲,从而增加了体重。 [22] 但短时间内会影响其食欲。而李树荣 等学者研究表明葫芦茶对叶蜂科幼虫及灯 蛾科幼虫都没有杀灭效果。 [23-24] [25] 文献还报道葫芦茶提取物能破坏HBsAg 。香卫红 等学者用葫芦茶、 七叶一枝花、毛冬青组成的配方对外伤瘀血模型大鼠的血液流变学有显著作用, 能改善血液的浓、聚、粘、凝,从而起到活血化瘀的功效。 [25] 于大永 等学者采用卵白蛋白(OVA)和氢氧化铝的混合液致敏和诱发大鼠 成为Ⅰ型过敏反应的动物模型,实验将其随机分为正常对照组、模型组(包括葫 芦茶地上部分的丙酮-水提取物低、高剂量组)、孟鲁司特钠(Menglusitena)阳性对 照组。实验测定致敏大鼠血清IgE 和LT含量是采用ELISA 法测定。检测大鼠全 BALF EOS 血和 中 数量是采用细胞计数法测定。还通过病理学检查肺组织炎症 的反应程度。结果表明葫芦茶地上部分50%丙酮-水提取物较模型组更显著的降 低大鼠血清IgE 和LT的含量,也更明显的减少全血和BALF 中EOS的数量以及 肺组织的炎症面积。据此推测葫芦茶的地上部分可能是通过抑制炎症介质的释放 从而降低炎症的反应,起到抗Ⅰ型过敏反应的作用。 1.2.3 葫芦茶的临床运用 葫芦茶性凉,具有清热解毒,消积利湿,杀虫防腐等功效,临床用于预防中 5 汕头大学硕士毕业论文 暑,治疗感冒发热、咽喉肿痛、急性肾炎、黄疸肝炎、肠炎、细菌性痢疾、妊娠 [14] 呕吐等 。 [26] 叶以健 学者以葫芦茶为主的药方对168例华支睾吸虫感染者进行治疗实 验,以23例患者服用西药(硫双二氯酚、呋喃丙胺)进行治疗作为对照组,结果 西药治疗药物的反应大且疗效欠佳,而药方组阴转率达94.6%,且无太大的不良 [27] 反应,具备了常用西药没有的优势。钟务超 用草药葫芦茶等自制的酸梅汤对 96 79 15 例蛔虫病进行治疗实验,结果治愈了 例,有显著疗效的有 例,无效的 [28] 有2例。罗新华 等学者应用自拟方祛虫生血丸对70例钩虫病合并重度贫血患 者的临床痊愈率为94.29%。 前列腺增生(Benign Prostisil Hypeip Lasia,简称BPH)是老年男子的常见多发 病,主要症状有膀胱刺激症状和由增生前列腺阻塞尿路导致的梗阻性症状。膀胱 刺激症状主要表现为尿急、夜尿增多、尿频、急迫性尿失禁;梗阻性症状表现为 尿线变细、血尿、尿滴沥、排尿无力、尿潴。 南京中医药大学附属医院男性科徐福松教授用蒲葫芦茶、石韦、公英、车前 [29] 子等组成的临床验方(公英葫芦茶)能有效治疗BPH。孙建明 采用公英葫芦 茶方对75 例由前列腺增生所致癃闭症进行治疗实验,总的有疗效的占93.4%; [30] 15 王醒等 学者通过控制公英葫芦茶加减方对 例膀胱积热证的前列腺增生所致 [31] 急性尿潴留进行治疗实验,结果有疗效的有13例,无效的有2 例。王占忠 报 道利用公英葫芦茶配方制作的合补中益气丸对98例前列腺增生进行治疗实验, 总的有治疗效果的占93.4%。临床研究采用公英葫芦茶方治疗由前列腺增生引起 [32] 的尿潴留有良好的效果。方铁生等 学者研究表明葫芦茶等草药配方对湿热瘀阻 型前列腺增生的总的有治疗效果的占93.4%。临床研究采用公英葫芦茶方治疗由 前列腺增生引起的尿潴留有良好的效果。 [33] 肖廷刚 学者用葫芦茶、地榆、九里明、白芨组的九白茶洗剂对89例烧伤 [34] 创面进行治疗实验, 结果全部治愈。欧声宜 用葫芦茶、黄柏、儿茶、枯矾、十 大功劳、白及、两面针等组成茶白合剂对其进行治疗实验,结果84例都被治愈, 5 50 16.7 治愈时间最短的 天,最长 天,平均为 天。 [35] 韦人鉴等学者 用葫芦茶、车前子、虎杖、板蓝根、绵茵陈搭配的复方虎杖 糖浆对34例急性病毒性肝炎黄疸型和9例无黄疸型患者进行治疗实验,结果临 6 汕头大学硕士毕业论文 床治愈的有41例、病情好转的有2例。 [36] 卫生部颁标准十二册 收载一个中西药复方制剂由葫芦茶、穿心莲、山芝麻、 板蓝根、三叉苦等10味药组成的治感佳片,可以治疗感冒发热头痛等症。 [37] 高水英 报道用葫芦茶组方对50例单纯性消化不良进行治疗研究,结果治 愈的有40 例, 有显著疗效的有6例,有一般疗效的有3例、无效的有1例。李 [38] 美春等学者 将葫芦茶做为主药进行搽浴、药敷、药熨、熏洗等的简单疗法对小 [39] 儿厌食、中暑、热痹、阴痒等有良好的疗效。葛槐发等学者 在临床上以葫芦茶 为主药对黄疸、食滞、热淋、痈、疳等多种疾病都有良好的治疗效果。 1.3 药用植物的解剖结构和化学成分的研究进展 目前,国际上崇尚自然、回归自然、选择自然已成为不可逆转的潮流,用天 然药物替代化学药品已成为今后国际医药发展的趋势。中草药的特色和优势顺应 了世界医药的发展趋势,在预防疾病、治疗和保健方面被越来越被人们所认同, 受到世界人民的青睐。 根据权威统计资料,我国现有中药资源12800多种,其中药用植物11146种, 药用动物1581种,药用矿物80多种。现有中药材生产基地600多个,全国药材 2 生产面积67万多hm ,常年栽培的药材近200余种,平均产量约1.25亿kg,我 国控制着全球中药产业的源头。我国有丰富的中药资源,这是任何其他国家都无 法比拟的。但是与此相差甚远的是,我国中药出口仅为世界贸易额的 3%-4%, 在国际中药市场占有率极低,其原因主要在于中药材质量不稳定,以及拿不出生 [40] 化理化指标,有效成分、农药和重金属残留的定量测试数据等 。 每种药用植物能防病治病主要是该植物的药用部分中含有相应的药用化学 成分,药用植物的结构与其有效成分的积累具有一定的相关性。将药用植物的结 构及其生长发育的研究结合该植物主要药用成分积累动态的测定,可以进一步了 解药用植物的结构与主要药用成分的关系,阐明其分布部位和贮存场所,可以了 [41] 解药用植物生长发育不同时期,主要药用成分含量的变化规律 。 植物的次生代谢产物产生于乙酸、莽草酸及甲羟戊酸等少数几个前提来自初 生代谢,经酶催化形成几大类基本骨架,再由各种类型的酶促反应进行修饰,产 7 汕头大学硕士毕业论文 [42] 生各种各样的次生代谢产物 。植物的次生代谢产物除受植物自身遗传因素控制 [43-44] 外,更多的受环境因素的影响,如病虫害的入侵,气候变化 。随着现代分子 生物学技术的发展,利用基因工程手段改造植物细胞,获得高产、高效、生产周 期短、低成本的下报喜,然后利用现代生物工艺大规模地培养细胞,甚至可以有 目的的改变植株的遗传特性,使目的基因超常表达,得到高效表达的代谢物。 细胞培养是实现工业化大生产的途径,与固体培养相比,细胞悬浮培养能使 细胞增殖加快,能大规模工业化生产,且能提供大量均已的培养物,对植物来讲, 利用植物细胞培养生产有价值的此生代谢产物是一种非常有用的可选择的手段 [45] [46-48] 。已有一些关于利用丹参细胞培养生产丹参酮类、可溶性类有效成分 。 关于植物的解剖结构及其成分含量变化的研究已有些先例,比如西北大学开 展的滇黄芩、丹参、喜树、虎杖、卵叶远志、柴胡、夏枯草、扁蓿豆等相关研究, 这些都是些常用的北药,而南药这方面的研究尚未见报道,从葫芦茶的药理作用 和临床应用可见其具有较高的药用价值。葫芦茶主产于广东、广西、海南、江西、 [1-2] 福建等南岭地区 ,是南药代表之一。目前葫芦茶的研究仍处于起步阶段,主 要集中在化学结构的鉴定,临床研究和毒理学研究,王永奇有关于葫芦茶的营 [14] 养器官的解剖结构的少量报道 ,尚缺乏能够结合营养器官结构特征、组织细 胞化学定位和含量相关性研究。因此,有必要对葫芦茶的解剖结构和有效成分分 布、含量及活性进行相关的研究。 1.4 药用植物黄酮类生物活性研究进展 草药植物提取物含有黄酮类物质、生物碱、多糖、挥发油、有机酸等生物活 性物质。黄酮类化合物广泛存在于植物的所有部分,包括根、茎、树皮、叶、花、 [49-50] [51] 果实中 ,它大多出现在于一些有色植物中,如甘草油性提取物 、山楂提取 [52] [53] [54] [55] 物 、柑橘皮提取物 、芝麻叶提取物 、银杏叶提取物 。黄酮类化合物在 植物体中通常与糖结合成苷类,小部分以游离态(苷元)的形式存在。绝大多数 植物体内都含有黄酮类化合物,它对植物的生长、发育、开花、结果以及抗菌等 方面起着重要的作用。黑莓、桃、杏、苹果、葡萄、柑橘、柠檬和樱桃等水果中 富含黄酮类物质,胡萝卜、芹菜、西红柿、菠菜、洋葱、西兰花、莴苣、黄瓜等 8 汕头大学硕士毕业论文 [56-57] 蔬菜中也含有较多黄酮类化合物 。 黄酮类化合物在植物界中分布较广,在生理学、医学和营养学上具有一定的 [58] 应用价值 ,黄酮物质在抗植物UV-B 辐射、铝毒害耐性、抵御天敌、提高植物 [59] 对物理环境的适应等方面都有一定的作用 ,具有抗氧化、抗过敏、抗炎、抗菌、 抗突变、抗肿瘤、保肝作用,还可以用作食品、化妆品的天然添加剂,如甜味剂、 [60] 抗氧化剂、食用色素等,市场前景广阔 。近年来,人们热衷于天然植物药的开 发,植物药以天然、低毒、绿色、可再生等特点备受关注。黄酮类化合物以广泛 的药理功能越发受关注,不同草药的黄酮类具有不同的生物活性,研究表明黄酮 类是葫芦茶的一类重要的有效成分,成分复杂,关于它的有效成分的生物活性 研究较少,有必要对其活性进行相关的研究。 1.4.1 抑菌活性 在食品工业中,食品的防腐始终是一个重要问题,据估计,全世界每年约有 10-20%的食物损失于各种腐败。食品腐败变质不仅会使食品丧失营养价值,还 会造成食物中毒。食品腐败的原因包括物理、化学、酶、微生物四个方面的因素, 其中微生物作用最为严重。食品的腐败变质主要是指以微生物作用为主的导致食 品质量下降。食品防腐主要是通过抑制、减缓或阻止腐败和致病微生物的生长以 [61] 及通过控制影响微生物生长的因素来实现的 。苯甲酸、山梨酸及其盐、对轻基 苯甲酸酷类是目前国内外实际使用的三大类主要食品防腐剂。这些添加剂大部分 都是化学合成的,对人们的身体健康具有潜在的威胁性,更天然、高效、安全的 防腐剂是人们所期盼,中药提取物作为食品的防腐剂,已经越来越受到食品、药 品领域的广泛关注。 谷肄静利用蒲公英总黄酮对黑曲霉、宛氏拟青霉、酿酒酵母和枯草杆菌进行 了抑菌试验研究。结果表明,0.43g/L(以芦丁计)的蒲公英总黄酮对宛式拟青霉和 枯草杆菌具有良好的抑菌作用,对酿酒酵母具有一定的抑菌作用,而对黑曲霉没 [62] 有抑菌作用。 杨林富等研究结果表明,黄荆提取物的浓缩液对细菌的抑制效果 很明显,被抑制的细菌中即有革兰阳性菌,也有革兰阴性菌;既有球菌也有杆菌, [63] 说明黄荆叶提取物对细菌有广泛抑制作用 。谢明杰等以从脱脂豆粕中提取的总 大豆异黄酮为试验材料研究其抑菌作用,结果表明,大豆异黄酮对金黄色葡萄球 9 汕头大学硕士毕业论文 菌、藤黄微球菌、腊状芽抱杆菌、短小芽抱杆茵、枯草芽抱杆菌、单增李氏茵、 白色念珠茵、梨头霉菌和米曲霉均有明显的抑制作用,其最低抑菌浓度(MIC)分 别为0.03%、0.09%、0.02%、0.03%、0.03%、0.05%、0.05%、0.05%和0.05%, [64] 但对大肠杆菌和酿酒酵母没有抑制作用 。王岳峰等研究大叶按黄酮类化合物的 抑菌活性表明:抑菌活性明显优于土霉素,认为该植物叶作为类抗生素饲料添加 [65] 剂的开发具有较高的实用及经济价值 。朱丹等研究了马齿觅黄酮类物质对几种 常见微生物的抑菌活性。结果表明:马齿觅黄酮类物质对细菌有较强的抑制作用, 对青霉、毛霉、根霉、黑曲霉的抑菌效果不明显,对啤酒酵母和热带假丝酵母无 抑制作用;对细菌的最小抑菌浓度(MIC)分别为:大肠杆菌0.0625%,枯草芽抱 杆菌0.0625%,金黄色葡萄球菌0.03125%;热处理对马齿览黄酮类物质的抑菌 [66] 效果无影响。 此外崔永明等研究甘草总黄酮对金黄色葡萄球菌,大肠埃希氏杆 [67] 菌,绿脓杆菌和枯草杆菌均有明显的抑制作用 ;许丽旋等对竹笋壳黄酮提取液 的抑菌效果进行了初步研究,实验结果证明了竹笋壳黄酮提取液有与竹叶黄酮相 [68] 当的生理活性 。张锡彬等研究表明红薯茎叶黄酮提取物对细菌的的抑制能力明 [69] 显大于对照苯甲酸钠和丙酸钙 。焦翔等研究青海产中国沙棘叶提取物抑菌活性 均优于内蒙占产大果沙棘叶;乙醇提取物总黄酮含量和抑菌效果均显著优于水提 [70] 取,超声辅助提取有助于提高提取物的抑菌活性 。 1.4.2 抗氧化性 自由基过量主要产生于人体非正常代谢产物、有毒化学品接触、毒品、吸烟、 酗酒、日晒、长期生活在富氧/缺氧环境、环境污染因素、过量运动、疾病、不 健康的饮食习惯、辐射污染、心理因素等原因。降低自由基危害就要从抗氧化做 起。由于细胞膜磷脂中多不饱和脂肪酸对自由基特别敏感,自由基可以攻击细胞 膜中的多不饱和脂肪酸(PUFA)而引发脂类链式反应,生成会破坏蛋白质正常 [71-72] 结构而导致细胞膜破损的过氧化脂类 。虽然人体内有消除机体内产生的各种 自由基的防御系统,但是当出现负荷状态时,自由基就会失去形成和消除的动态 平衡,从而攻击细胞组织引发的多种疾病,比如心血管疾病、衰老、肿瘤等。合 理服用抗氧化剂或自由基清除剂都可以有效控制这些疾病的发生,发挥良好的防 10 汕头大学硕士毕业论文 [73] 御作用 。60年代以来,人们对黄酮或酚类化合物的抗氧化性,特别是在食用 [74-75] 油脂中的抗氧化作用作了大量研究 。 目前己有报道的天然黄酮类化合物有九大类,各类间以及每一类中不同的黄 酮单体其抗氧化活性有较大差异。这是因为黄酮类化合物清除自由基的能力由化 学结构所决定。试验表明,黄酮类物质在抗氧化反应中不仅能清除链引发阶段的 自由基,而且可以直接捕获自由基反应链中的自由基,阻断自由基链反应,起到 预防和断链的双重作用,是优良的天然抗氧化剂,其具体反应机制可能是酚轻基 与自由基反应生成共振稳定的半醒式自由基结构,从而终止自由基链式反应。其 反应可以表达为:[flavone-OH]+R.+[flavome-O.]+RH;其次,B 环上邻二酚轻基 的存在,极大增强了其抗氧化活性,可以认为是高效黄酮类抗氧化剂的结构基础, 具有强抗氧活性的此类化合物一般都有邻苯二酚结构;再者,C 环上3-OH,2,3 4- [76] 之间的双键以及毗邻的 碳基对抗氧化活性都有较大影响 。 黄酮类化合物还有很强的抗油脂氧化作用。吕应年等研究半边旗中黄酮抗油 [77] 脂过氧化性,用Na S O -I 滴定试验考察发现其具有良好的抗氧化活性 。李志 2 2 3 2 洲对苦瓜中黄酮类化合物抗氧化性进行研究,结果表明:苦瓜中提取的黄酮类化 [78] 合物对猪油的氧化有明显的抑制作用,且随加入量的增多,抗氧化能力增强 。 吴春等研究杜仲黄酮抗氧化活性,结果表明:杜仲黄酮对猪油具有明显的抗氧化 活性,部分有机酸对其具有一定的增效作用,添加质量分数为0.30%杜仲黄酮可 [79] 使猪油在20℃下的货价寿命由2.5个月延长至8.1个月 。丁利君等研究山茱英 [80] 黄酮抗氧化作用,结果表明山茱英对猪油有明显的抗氧化作用 。 1.4.3 抗肿瘤活性 黄酮是一种广泛分布于多种植物中的具有多种生物活性的天然化合物,具有 多种生物活性。近年来研究发现,黄酮类化合物对多种恶性肿瘤细胞生长有抑制 [81] [82] [83] [84] 作用,如乳肝癌 、腺癌 、胃癌 、宫颈癌 等,槲皮素可以抑制某些肿瘤 [85] 的侵袭能力,颇具应用前景 。许多黄酮类化合物具有抑制肿瘤细胞糖酵解、生 长及线粒体琥珀酸氧化酶活性和存在于卵巢癌细胞中的磷脂酰肌醇激酶活性的 [86-87] 功能,因此能抗癌、防癌,还可以保护细胞免受致癌因子的损害 。中药中提 取的的黄酮类物质有芦丁、槲皮素、葛根素、甘草甙等,是一类具有多种药理活 11 汕头大学硕士毕业论文 性的天然多酚类化合物,具有明显的抑制病毒活性作用。张奉学等通过体外实验 发现黄芩苷有显著的体外抑制乙型肝炎病毒作用,此外一些中草药类的黄酮还可 以刺激机体的免疫系统产生肿瘤坏死因子、干扰素、白细胞介素等细胞因子,增 强机体免疫功能,如一些黄酮类化合物如表儿茶素、高良姜素和山奈酚等成分能 [88-91] 直接杀灭疱疹病毒,阻断病毒感染 。 肿瘤是指机体在各种致癌因素作用下,局部组织的某个细胞在基因水平上失 去对其生长的正常调控,导致其克隆性异常增生而形成的新生物。包括良性肿瘤 和恶性肿瘤。肿瘤严重威胁着人类的健康,而当前相关药物防治癌症的效果不是 [92] 很好,因此抗肿瘤药物,尤其是天然植物在国内已成为肿瘤治疗研究的热点 。 MTT 法全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide法是 [93-96] 检测细胞活性的常用方法 。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能 使外源性MTT 还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒并沉积在细胞中,而死细胞无 此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒,用酶联免疫检测仪在490nm 波长处测定其光吸收值,可间接反映活细胞数量。在MTT 比色分析中,细胞接 种量、单细胞悬液制备、细胞存活率、药物剂量及作用时间对肿瘤细胞的药物敏 [97] 感性都有影响 。细胞生物学研究推测细胞中毒的过程中,线粒体呼吸链上的琥 珀酸脱氢酶能脱下琥珀酸的氢原子,使之氧化成延胡索酸,而染料MTT 作为脱 下氢原子的接受剂,被还原成蓝紫色的产物,通过分光光度计检测颜色的深浅变 [98] 化,能定量的反映细胞数活性的变化 。活细胞即具有代谢活性的细胞,无论静 止期或者分裂期,都能还原MTT,其还原程度与细胞活性相关。MTT 检测法简 便、快速、经济且临床疗效相关性好,在多种体外抗癌药物的筛选方法中MTT [99] 法是今年来备受推崇的检测方法 ,近几年被广泛应用于临床恶性肿瘤如白血病 [100] 胃癌、肺癌、乳腺癌等的化疗药敏检测 。 1.5 课题研究的内容、目的及意义 本课题主要采用植物解剖学、组织化学定位、植物化学以及HPLC 分析方法 较系统地分析葫芦茶有效成分的组织分布、积累及其在不同器官不同时期的含量 差异和变化;摸索合适的分析葫芦茶中总黄酮和总酚的高效液相色谱条件;初步 12 汕头大学硕士毕业论文 研究葫芦茶总黄酮物质的抑菌活性、抗氧化活性以及体外抗肿瘤活性。为葫芦茶 主要药效成分的合成、转运和储藏途径及生物活性的深入研究提供理论支持,也 为葫芦茶的种植、采收、品质鉴定及其制品的开发研究、综合利用提供参考。 13 汕头大学硕士毕业论文 第2章 葫芦茶营养器官结构解剖学研究 2.1 材料 实验材料葫芦茶采摘于广东省汕头大学桑普山,材料经潮州韩山师范学院生 物系陈树思教授鉴定(标本h2011111501现保存于汕头大学理学院生物系遗传实 验室),于2010年11-12月、2011年3-10月,总共10个月,每月月中旬左右采 集。 德国LeicaCM1100冰冻切片机,OCT包埋剂,倒置显微镜等。 2.2 方法-冰冻切片法 由于OCT冰冻切片包埋剂是一种聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物,普 遍用于免疫组化实验,其主要作用是在切片时支撑组织,减少组织皱折及碎裂。 且OCT混合物为水溶性的就能在漂片时溶于水,因此不会对切片染色观察产生 干扰。 利用OCT混合物预先浸润组织,然后再进行恒冷箱切片,使切片质量得 到改善。 取葫芦茶不同发育时期的根、茎、叶,将材料切成小块,加OCT包埋剂于4 ℃冰冻20min 左右,让包埋剂尽量渗透进组织,尽量保证切片的完整性。德国 Leica CM1100冰冻切片机切片,切片厚度为10~20μm,切片采用番红-固绿染液 对染,显微镜观察。 2.3 结果和分析 2.3.1 叶的形态结构 2.3.1.1 叶的形态 葫芦茶的叶为单叶互生,叶片卵状披针形至狭披针形,长6~15cm,宽1~4cm, 14 汕头大学硕士毕业论文 先端急尖,基部浅心形或圆形;叶柄具宽翅,形似葫芦;托叶2枚,披针形,有 1~3cm 4~8mm 2 纵脉。叶柄长 ,具阔翅,翅宽 ,与叶同质,先端有小托叶 枚, 托叶大,阔披针形,有纵脉。 2.3.1.2 叶的表皮结构 葫芦茶的叶片为异面叶,由表皮、叶肉和叶脉组成。上下表皮均由排列紧密 的多边形细胞构成,葫芦茶上下表皮均有气孔器分布,有平列型和不等型,保卫 细胞里分布有叶绿体,能进行光合作用。上下表皮细胞垂周壁均为波浪状(图版 Ⅰ:1-2),且都分布有单细胞的表皮毛(图版Ⅰ:3),并且越幼嫩的叶中分布越 多。 2.3.1.3 叶的内部结构 横切面上叶片由表皮、叶肉和叶脉组成。上下表皮均由1层细胞组成,具角 质层(图版Ⅰ:4);上表皮细胞较大,近方形,排列紧密,下表皮细胞较小,排 列紧密(图版Ⅰ:5);叶肉由栅栏组织和海绵组织构成,其间分布有侧脉维管束 (图版Ⅰ:5),栅栏组织由1-2层长柱形的细胞构成,排列整齐紧密,细胞长轴 与叶表面相垂直;海绵组织位于远轴面,细胞形状不规则,排列不整齐,胞间隙 较大,叶中脉发达,中脉维管束在叶上面突出,突出部位由厚角组织构成,侧脉 维管束分布在叶肉中。主脉维管束(图版Ⅰ:6)有由厚壁细胞构成的维管束鞘 构成。嫩叶中脉(图版Ⅰ:4)由7个维管束构成,呈环状排列几成一体,为外 韧维管束,由1圈几成环状排列的厚壁细胞构成的维管束鞘包围,老叶中脉结构 与嫩叶中脉相似,所不同的是,老叶中脉中的维管束已结合而成2小1大的状态 (图版Ⅰ:7)。 2.3.2 茎的形态结构 2.3.2.1 茎的形态 葫芦茶的嫩茎呈三棱状,分布着柔软的小绒毛,茎是粉色的,较柔软。老 15 汕头大学硕士毕业论文 茎呈圆柱状,绿色的,秃净,坚硬,材质。 2.3.2.2 茎的初生结构 葫芦茶的嫩茎近三棱形,老茎近圆形,嫩茎(图版Ⅰ:8)由表皮、皮层和 维管柱3部分组成。表皮为一层较小的排列紧密的薄壁细胞构成,棱角处由一团 厚角细胞组成,皮层细胞较小,排列紧密,维管柱主要由木质部、韧皮部和髓部 组成。木质部较宽,韧皮部较窄,韧皮部外的纤维束散布,断续成环,导管单个 散布或2~3个形成孔链,木射线列细胞径向延长。茎的中央为由基本分生 组织分化产生的髓部,髓部较大,均为薄壁细胞,细胞近圆形,体积大,胞间隙 发达。 2.3.2.3 茎的次生结构 老茎(图版Ⅰ:9-10)木栓层由4~8列近长方形细胞组成,细胞外壁增厚, 木化。皮层较窄,细胞近圆形,韧皮部外方有纤维束散布,断续成环。木质部变 大,导管或单个散布或2到多个形成孔团或多个导管成单列排列的孔链,木射线列细胞径向延长构成。由于受到木质部生长的压力,髓部逐渐变小。 2.3.3 根的形态结构 2.3.3.1 外部形态 葫芦茶的根系不是很发达,主根上有很多细小的不定根,主根稍微粗些,不 定根很细,根的表面是浅黄白色的,长圆柱形,直的或弯曲的,有时具分枝和须 根,长短差别较大,长5~20cm,直径约0.2~2cm,入土较深,质地柔韧,不易 折断。 2.3.3.2 内部结构 葫芦茶的根(图版Ⅰ:11-12)由周皮和次生维管组织构成。周皮包括木栓 16 汕头大学硕士毕业论文 层、木拴形成层和栓内层。根的最外层为木栓层,木栓细胞呈扁平形,排列紧密。 木栓形成层由若干层细胞构成,细胞方形,栓内层由多层薄壁组织细胞组成。次 生维管组织包括次生韧皮部和次生木质部。次生韧皮部有大量的韧皮薄壁细胞, 还分布有大量筛管和伴胞,次生木质部呈辐射状排列,次生木质部发达,由木薄 壁细胞、导管和木射线构成,导管或单个散布或2到多个形成孔团或多个导管成 单列排列的孔链,维管射线明显,导管里有晶体分布(图版Ⅰ:13)。 17 汕头大学硕士毕业论文 第3章 葫芦茶器官有效成分的组织化学定位和含量 研究 3.1 材料和方法 3.1.1 材料 3.1.1.1 植物材料 同2.1,将采回来的材料按营养器官分为:根、茎、叶、荚果。洗净,风干, 粉碎,过筛,备用。 3.1.1.2 仪器药品 德国Leica CM1100冰冻切片机,OCT包埋剂,德国Agilent 1100 安捷伦高 效液相色谱仪,万能粉碎机,电子天平,超声波破碎仪,芦丁标准品(中国药品 生物制品检验所,批号:10),没食子酸标准品(上海源叶生物科 技有限公司)等。 3.1.2 方法 3.1.2.1 形态解剖学 2.2 70% 同 ,切片进行显色观察,对照组材料是经 酒精浸泡若干天后再切片 显色观察。 3.1.2.2 组织化学定位 显色定位溶液为5%NaOH溶液,5%香草醛-冰乙酸:高氯酸:冰乙酸(1:4:5), 2%(w/v)香草醛-浓盐酸溶液,即配即用。 18 汕头大学硕士毕业论文 3.1.2.3 总黄酮含量的测定 色谱条件:甲醇∶水(55:45),流速1ml/min,柱温25℃,10μl进样,257nm, [61] DAD 。高效液相色谱法测定,以峰面积和浓度绘制标准曲线,在0-160mg/L 范围内线] 根、茎、叶、荚果分别称取1g,按照如下提取 ,1g加55ml 65%乙醇45℃35min 400W,超声5min,微波低火水解5min,过滤,浓缩,分别用20ml 50%甲醇溶 0.45μm 3 解, 有机微孔膜过滤测定。每个样品 个重复,按标准曲线计算样品总 黄酮含量,取平均值。 AAAA BBBB 3.1 (A) (B)HPLC 图 芦丁标准品 和葫芦茶样品 色谱图 Fig.3.1Rutin chromaotgrams of referencesubstance (A) andsample (B) 图 3.2 芦丁标准曲线Standard curve of Rutin ①精密度测定 精密吸取芦丁对照品溶液10μl,按照上述色谱条件重复进样6次,测得峰 面积分别为799.0132,799.4014,799.0096,821.0121,795.40161,799.6009, 799.3571,根据其平均值和标准差求得峰面积的RSD 为0.0116%,精密度好。 19 汕头大学硕士毕业论文 ②重复性实验 12 3 3.2.2.3 取葫芦茶的 月荚果的样品 份,按照“

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